Studiul și evaluarea carcinogenezei

Carcinogeneza este studiată cu diferite teste toxicologice standardizate. O primă parte a acestor teste se efectuează in vitro și - dacă sunt pozitive - continuăm cu o experimentare in vivo. Această abordare experimentală pas cu pas se numește DECIZION POINT APPROACH, o succesiune de studii care se opresc la sfârșitul fiecărui proces pentru a decide cum să procedăm cu procesul. Există cinci etape:

FASA A: structura și caracteristicile compusului cancerigen;

FASEB: în această fază a testării in vitro pe termen scurt, se folosesc celule de mamifere. Cele mai frecvent utilizate celule sunt hepatocitele, deoarece este studiată amploarea reparării până la deteriorarea pe care hepatocitul o dezvoltă în funcție de gravitatea daunelor cauzate de substanță. Pe scurt, nu determinăm daunele în sine, ci cât din sistemul de reparații a fost activat de celula hepatică.

Procedura implementată este formarea a 3 culturi de hepatocite. În prima cultură, hepatocitele sunt sănătoase, în cea de-a doua sunt tratate cu substanța testată și în cele din urmă în cea de-a treia sunt tratate cu o substanță martor care este cu siguranță cancerigenă.Aceste trei culturi conțin o bază pirimidinică radioactivă, care este timidina tritiată, care acționează ca un marker.

Dacă compusul examinat provoacă o mutație în ADN, celula răspunde la această problemă prin activarea sistemelor de reparații. Bucata de ADN care a suferit mutația este tăiată și datorită acțiunii ADN-polimerazei, bucata lipsă este înlocuită cu una nouă. Pentru corectare, ADN-polimeraza folosește noile baze, inclusiv timidina trită. Analiza radioactivității determină nivelul mutației din celulele tratate: cu cât este mai mare radioactivitatea, cu atât sunt mai mari mutațiile ADN-ului.

De asemenea, în faza B se efectuează și teste pe bacterii, pentru a putea studia dacă există mutații inverse. Bacteriile utilizate sunt salmonele deja purtătoare de mutații. Mutația se referă la sinteza histidinei, astfel încât salmonelele nu pot crește fără histidină. Aceste colonii bacteriene sunt parțial tratate cu substanța testată, parțial pentru controlul negativ și parțial pentru controlul pozitiv, apoi testate cu un cancerigen cunoscut. Dacă această substanță de testat este un genotoxic indirect, enzimele metabolizante trebuie introduse în mediul de cultură. În acest moment, există 3 culturi care vor fi însămânțate și crescute în cutii Petri (nu există histidină în mediul de cultură). Dacă nu au existat mutații ale carcinogenului care urmează să fie testat, teoretic nu ar trebui să existe niciunul pe plăci Dacă a existat o acțiune mutagenă a cancerigenului, este posibil să fi schimbat prima mutație și să fi creat o a doua mutație capabilă să crească bacteriile pe mediul de cultură fără histidină. În acest caz, a doua mutație care modifică prima mutație și ia numele de RETROMUTARE În cele din urmă, dacă apare o creștere semnificativă în piața petri, cancerigenul este direct.
Întotdeauna cu un test in vitro este posibil să se determine integritatea cromozomială. Acest test se efectuează întotdeauna pe celule de mamifere și este utilizat pentru a testa substanțe toxice capabile să provoace mutații pe unele enzime responsabile de biosinteza ADN-ului. este supus analizei in vitro Pentru a putea stabili dacă substanța examinată afectează integritatea și numărul de cromozomi prezenți, se folosește testul micronucleului. Micronucleele sunt vezicule care se formează cu o parte a cromatinei din interior. Cromatina încorporată în aceste micronuclei ar putea fi fie cromozomi întregi, fie fragmente de cromozomi. Micronuclei sunt formați prin divizarea celulară greșită, dând naștere celulelor fiice cu material genetic nu în mod egal. Rezultatul acestui test va fi determinarea substanțelor care sunt definite otrăvuri clastogene și fusiforme. Substanța clastogenă produce micronucleii cu fragmente acentrice de cromozomi, astfel încât substanța induce o rupere a cromozomilor, în schimb substanța otrăvitoare a fusului produce micronuclei care în interiorul său sunt prezenți cromozomi întregi.
Dacă substanța examinată induce genotoxicitatea într-unul sau mai multe teste, aceasta este definită ca fiind foarte suspectă, deci trece direct la faza D. Dacă, pe de altă parte, substanța testată nu produce niciun efect genotoxic, trece la faza de studiu. C pentru că poate fi promotor.

FASEC: în această fază pot fi efectuate atât teste in vitro, cât și in vivo.

Pentru testele in vitro s-a putut demonstra posibilitatea ca substanța promotor să rupă joncțiunile dintre celulele normale și celulele tumorale, cu trecerea consecventă a substanțelor între cele două celule.

Un test in vivo este inducerea tumorilor cutanate la șoareci. Substanța de testat se aplică de două sau trei ori într-o săptămână pe pielea șoarecelui. În termen de 2/3 luni, dacă această substanță este un promotor, pot exista formațiuni de papilom. La șoareci, sunt luate în considerare două date principale: numărul șoarecilor afectați de papiloame și numărul de papiloame prezente pe fiecare animal. Dacă substanța acționează ca promotor și dezvoltă o tumoare la șoarecele tratat înseamnă că este într-adevăr o substanță cu efect promotor.

Odată finalizate aceste teste, trecem la teste in vivo pe termen lung.

FAZAT: în această fază sunt testați toți compușii care se dovedesc mutageni și toți compușii care nu se dovedesc mutageni. Testele care pot fi efectuate sunt diferite, dintre care unele sunt teste efectuate pe ficat, pe plămâni și în final pe sân.

Testul hepatic demonstrează formarea nu a unei tumori nou formate, ci a unui focus neoplazic, deci ceva care se pregătește să devină o tumoare. Celulele acestui focus sunt deja celule atipice, prin urmare au suferit o mutație și se pregătesc să devină celule neoplazice. După un anumit timp, datorită examinării autopsiei, se determină formarea focalizărilor pre-neoplazice, prin calcularea numărului și întinderii acestor formațiuni pre-neoplazice.

Testul pulmonar permite determinarea unui adenom, care este o „anomalie a celulelor țesutului pulmonar. De asemenea, în acest caz țesutul pulmonar al șobolanului este examinat după un timp destul de lung (luni) (aceste adenoame sunt ușor de identificat deoarece sunt noduli albicios pe epiteliul pulmonar).
Testul mamar permite determinarea tumorilor din țesutul glandular. Numărul adenoamelor formate și numărul animalelor care prezintă adenoame sunt întotdeauna evaluate.

Dacă există rezultate pozitive în urma acestor teste, substanța testată este cu adevărat cancerigenă. În acest moment trecem la efectuarea unor teste costisitoare cu timpi de execuție foarte lungi.

FAZĂ: în această fază, un număr variabil de animale, de la 20 la 50, sunt supuse testelor pe termen lung. Aceste teste sunt foarte costisitoare și necesită mult timp pentru a obține anumite rezultate; vorbim despre aproximativ 1/8 din viața animalului.Este posibil ca în timpul acestor teste să moară unele animale, dar ele sunt întotdeauna studiate cu o autopsie și un examen de tip histologic. Animalele alese sunt întotdeauna șobolani și șoareci și doar 70-80% supraviețuiesc până la sfârșitul testelor pe termen lung. Animalele folosite sunt doar înțărcate, cu cât sunt mai tinere, cu atât sunt mai sensibile la tratamente. În timpul perioadei de testare pe termen lung, cercetătorul este întotdeauna susținut de un matematician-statistician, capabil să ia în considerare toate informațiile colectate și să reproducă diferitele date.

Dozele testate pe animale pornesc de la doza maximă tolerată și de la toate multiplele sale și se evaluează reacția doză-răspuns la animal.
Administrarea trebuie să abordeze întotdeauna calea prin care omul poate intra în contact cu substanța examinată, deci calea orală, cutanată sau respiratorie, în timp ce dacă se testează carcinogenitatea unui medicament este utilă și efectuarea administrării intravenoase.
Grupurile de animale testate sunt 4 (50 de animale pentru fiecare grup):

Un grup NAIF care nu are tratament;
Un grup tratat cu vehiculul;
Un grup tratat cu substanța testată;
Un grup tratat cu un cancerigen cunoscut.

Este foarte important ca numărul de animale din fiecare grup să fie cât mai egal posibil. De fapt, dacă există prea multe diferențe în numărul de animale, testul statistic se poate dovedi a fi fals.
Evaluările care se efectuează sunt:

Frecvența totală a tumorilor;
Frecvența unor tumori;
Frecvența animalelor cu mai multe tipuri de tumori;
Numărul cancerelor la animale.

La sfârșitul tuturor acestor faze de studiu, substanța este clasificată într-un clasament stabilit de IARC (Agenția Internațională pentru Cercetare și Dezvoltare a Cancerului) și de Agenția pentru Protecția Mediului (EPA).